PCR

PCR

Technika PCR jest niezastąpiona w badaniach genetycznych i medycznych. Umożliwiła wprowadzenie nowych metod diagnostycznych, analiz genetycznych i sądowych oraz biotechnologicznych. Poznaj proponowane w ABO gotowe zestawy do PCR, bufory, nukleotydy i polimerazy.

Technika PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) pozwala na szybkie i skuteczne powielanie określonych fragmentów DNA w ogromnych ilościach sięgających nawet milionów bądź miliardów kopii DNA. Uzyskane kopie mogą składać się z kilkuset lub kilku tysięcy par zasad. Wielokrotnie powtarzane cykle termiczne mają określone etapy zachodzące w rozmaitych temperaturach. Każda zmiana temperatury odpowiada konkretnej fazie reakcji – hybrydyzacji starterów DNA, denaturacji i elongacji przez polimerazę DNA.

Technikę PCR opracował Kary Mullis w 1983 roku w Stanach Zjednoczonych. W 1993 roku uhonorowano go nagrodą Nobla w dziedzinie chemii.
Mieszanina reakcyjna używana w PCR zawiera: DNA matrycowe, startery DNA, polimerazę DNA, nukleotydy oraz sole buforowe gwarantujące właściwe warunki pH i jonowe dla enzymatycznej aktywności polimerazy DNA.

Skład mieszaniny PCR

Matrycowe DNA

Jest to jeden z najważniejszych składników mieszaniny PCR. Stanowi DNA zawierające sekwencję docelową, która ma zostać powielona w trakcie PCR. Matrycowe DNA można wyizolować z rozmaitych źródeł, takich jak fragmenty plazmidów, klonowane geny, genom całkowity bądź sekwencje DNA o innym pochodzeniu.

Zanim rozpocznie się reakcję PCR, należy sprawdzić stężenie i czystość używanej jako matryca próbki. Zbyt wysoki poziom stężenia DNA matrycowego negatywnie wpłynie na efekty PCR. Przebieg reakcji mogą zakłócić również odczynniki zastosowane do izolacji materiału genetycznego. Dlatego ważne, by odpowiednio przygotować próbkę przed jej użyciem w reakcji PCR.

Startery (primery PCR)

Są to krótkie sekwencje DNA składające się zazwyczaj z 20 nukleotydów, chociaż ich długość różni się w zależności od danego zastosowania techniki PCR. Odgrywają istotną rolę w kwestii prawidłowego przebiegu amplifikacji sekwencji DNA. Primery PCR są zaprojektowane w taki sposób, by pasować do końców powielanej sekwencji DNA. W przypadku PCR stosuje się termostabilne polimerazy DNA odporne na denaturację w wysokich temperaturach.

Termostabilna polimeraza DNA

Głównym enzymem w reakcji PCR jest termostabilna polimeraza DNA. Jest ona zdolna do katalizowania syntezy nowych nici DNA na matrycy DNA. Dzięki właściwościom termostabilnym zachowuje aktywność enzymatyczną nawet podczas wysokich temperatur zachodzących w trakcie reakcji PCR.

Mieszanina nukleotydów

Do syntezy nowych nici DNA polimeraza zużywa dostarczone w formie mieszaniny nukleotydy, takie jak: dATP (deoksyadenozynotrifosforan), dGTP (deoksyguanozynotrifosforan), dCTP (deoksykozynotrifosforan) oraz dTTP (deoksytyminotrifosforan).

Każdy z tych nukleotydów odpowiada kolejno adeninie, guaninie, cytozynie i tyminie. Mieszanina zapewnia polimerazie DNA substraty niezbędne do budowy nowych nici.

Bufory do PCR

Dla zagwarantowania odpowiedniej aktywności polimerazy DNA w trakcie reakcji PCR do mieszaniny należy dodać właściwy bufor zawierający niezbędne jony.

Gotowa mieszanina reakcyjna jest umieszczana w niewielkich probówkach nazywanych PCR-ówkami. Następnie są one przenoszone do termocyklera wyposażonego w bloki grzejne podgrzewające mieszaninę do odpowiedniej temperatury wymaganej przez protokół PCR. Cykliczne podgrzewanie i chłodzenie pozwala na efektywną amplifikację DNA.

PCR – zastosowania

Amplifikowane DNA może zostać poddane wizualizacji za pomocą elektroforezy żelowej, przesłane do sekwencjonowania, podporządkowane trawieniu enzymami restrykcyjnymi lub użyte do klonowania z zastosowaniem plazmidów.

PCR jest szeroko stosowane w diagnostyce medycznej, praktyce kryminalistycznej oraz testach genetycznych. Wykorzystuje się je do wykrywania DNA bakterii lub wirusów w próbkach pacjentów. Możliwe jest amplifikowanie fragmentów DNA z próbki krwi lub tkanki w celu dalszej identyfikacji i analizy. W diagnostyce genetycznej PCR używa się do amplifikacji genów związanych z zaburzeniami genetycznymi oraz do analizy DNA płodu w badaniach prenatalnych.

Zapraszamy do poznania produktów do przeprowadzania reakcji PCR dostępnych w naszym sklepie online. Proponujemy także zestawy do qPCR.