5’… G G T G A  (N)₈↓…3’

3’… C C A C T   (N)_7↑…5’

Stężenie:                       10 u/µl 

Źródło:                         E. coli niosąca wklonowany gen hphIR z Haemophilus parahaemolyticus

Dostarczana wraz z:        1ml 10x Bufor Tango

                                   1ml 10x Bufor B                                 

Przechowywanie: -20ºC

BSA dołączona.

ZALECENIA:

1x Bufor B (do 100% trawienia)

10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM chlorek magnezu, 0,1 mg/ml BSA.

Inkubować w 37ºC.

Definicja jednostki enzymu: jedna jednostka enzymu to taka ilość enzymu, która jest zdolna do trawienia 1 μg fagowego lambda DNA dam^- w czasie 1 godziny w 37ºC w 50 μl buforu.

Rozcieńczenie: Rozcieńczać buforem do rozcieńczania Diluent Buffer (#B19): 10 mM Tris-HCl, (pH 7,4 w 25ºC), 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,2 mg/ml BSA i 50% glicerol.

Podwójne trawienie: Bufor Tango zapewnia uproszczoną procedurę związaną z podwójnym trawieniem. 98% Enzymów restrykcyjnych Thermo Scientific doskonale trawi w buforach 1x i 2x. Więcej informacji na stronie www.fermentas.com/doubledigest

Bufor Tango: 33 mM Tris-octan (pH 7,9), 10 mM octanu magnezu, 66 mM octanu potasu, 0,1 mg/ml BSA).

Bufor do przechowywania:

10 mM Tris-HCl (pH 7,5 w 25ºC), 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0.2 mg/ml BSA i 50% glicerol.

Zalecany protokół trawienia

• Dodaj:

woda wolna od nukleaz         16 µl

10X Buffer B                             2 µl

DNA (0.5-1 µg/ µl)                   1 µl

HphI                                    0.5-2 µl*

• Delikatnie wymieszaj i zwiruj przez kilka sekund.
• Inkubuj w 37°C przez 1-16h*.

Zalecany protokół trawienia produktów PCR bezpośrednio po amplifikacji

• Dodaj:

mieszanina reakcyjna PCR     10 µl (~0.1-0,5 µg DNA)

woda wolna od nukleaz         18 µl

10X Buffer B                             2 µl

HphI                                        1-2 µl*

• Delikatnie wymieszaj i zwiruj przez kilka sekund.
• Inkubuj w 37°C przez 1-16h*.

* Sprawdź test na nadtrawienie (overdigestion assay)

Inaktywacja cieplna:

20 minut w 65ºC.

WŁAŚCIWOŚCI ENZYMU

Aktywność % enzymu w buforach Thermo Scientific.

Efekt metylacji:

Dam: może się nałożyć- zablokowany

Dcm: może się nałożyć- brak efektu

CpG: może się nałożyć- brak efektu

EcoKI: nigdy się nie nakłada- brak efektu

EcoBI: może się nałożyć- zablokowany

 Stabilność w czasie wydłużonej inkubacji:

Jako minimum 0,1 jednostki enzymu jest wymagana do kompletnego trawienia 1 μg lambda DNA w ciągu 16 godzin w 37°C.

 Ilość rozpoznawanych miejsc cięcia w DNA:

 Uwagi

HphI jest blokowany przez nakładanie się metylacji dam. Aby tego uniknąć użyj szczepów dam^-, dcm^- takich jak GM2163.

Certyfikat jakości                   

Test na nadtrawienie (overdigestion)

• Nie obserwuje się zmian w specyficznej fragmentacji po 80-krotnie zwiększonych warunkach trawienia (5 u/μg lambda DNA  dam^- przez 16 godzin).

Test ligacji/ponownego cięcia

• Po 50-krotnym nadtrawieniu (3 u/μg DNA przez 17 godzin) więcej niż 70% fragmentów może być zligowane na końcu 5’ (koncentracja 1,7 μM). Więcej niż 90% z tego może ponownie zostać przecięta.